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文件名稱: | 線性 PEI(78PEI25000)轉染說明書 |
公司名稱: | 上海起發實驗試劑有限公司 |
下載次數: | 388 |
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線性 PEI(78PEI25000)轉染說明書
化學名:線性聚乙烯亞胺,線性 PEI,聚乙烯亞胺,線性,MW 25000,
轉染級
CAS#: 9002-98-6,26913-06-4
分子式 (CH2CH2NH)n
分子量: 25,000
規格:100mg 500mg 5g
熔點: 73-75o
溶于:熱水,低 pH 冷水,甲醇和乙醇。不溶于:苯,乙醚和丙酮外觀:
白色至黃色固體
處理:手套和通風櫥
分子量:25KD
儲存: PEI 內含自由氨基,建議開封后 4℃干燥保存,減緩氧化過程。
配置:
1:稱取 100mg 線性聚乙烯亞胺,加新鮮
的細胞級別的水 90ml,加鹽酸至 PH=3 左
右, 加熱至 80℃左右攪拌過夜溶解 PEI,
2:用氫氧化鈉溶液調整 pH 值至 7.0 ,定
容至 100ml,用 0.22um 的濾器過濾,分
裝后儲存于 4℃,保質期可以達到 12 個月。
轉染操作流程 (穩定轉染方法)
1. 接種細胞: 轉染前一天,用膠原酶(WORTHINGTONG 公司 LS004196)消化細
胞并計數(不建議用胰酶)。調整細胞濃度,將細胞鋪入細胞培養的器皿,每個孔置
入的細胞量應能使轉染時細胞匯合度達到 70~80%。
2. 準備 DNA-PEI 復合物: DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升
至室溫。依據表 1 所示,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他適合的無蛋白培
養基稀釋適量 DNA。用同樣的培養基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 線
性 PEI 轉染試劑(這個需要客戶自行摸索配比,每一批轉染試劑和每一批 DNA 比例可
能會稍有不同)。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管,一邊將稀釋的線性 PEI 轉染
試劑滴加至試管中(注意:請勿顛倒添加順序)。充分混勻后,室溫靜置 10~25 min
以形成 DNA-PEI 復合物。當溶液體積較大時,請用圓底聚丙烯管,例如 NEST 5 mL
/14 mL 離心管。
3. 轉染細胞: 直接向每個孔中加入 DNA-PEI 復合物并輕輕渦旋培養板/培養皿。在
無血清條件下轉染時,去除生長培養基,替換成無血清培養基,然后滴 DNA-PEI 復合
物。轉染 3 h 后,添加?體積的包含 30%血清的生長培養基。
4. 孵育細胞和分析結果: 在 CO2 培養箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉染
后最快 7 h 即可檢測到轉入基因的表達。
5.轉染 24 h 后,將細胞傳代至新鮮的生長培養基中(將細胞稀釋 10 倍 以上),在
CO2 培養箱中 37℃孵育過夜。第二天加入與轉染抗性基因相匹配的篩選藥物。約
1~2 周可 篩選到耐藥性克隆,在這期間需經常更換含篩選藥物的生長培養基。
特別提醒
1 .PEI 25K 含有 4-11%的殘留丙?;?,這可能阻礙聚合物主鏈與 DNA 的有效
結合,所以批間轉染效率可能會有比較大的差異,建議一個批次可以多購買,PEI
25K 穩定性在室溫干燥避光下可穩定保存 10 年以上(雖然有效期標注只有 18
個月左右)。
2. 對于某些類型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞,在
轉染前兩天鋪板,可顯著提高轉入基因的表達水平。如果選擇轉染前兩天鋪板,
可適當降低鋪板密度,以確保轉染時細胞的匯合度仍為 70~80%。
3. 對于接觸抑制敏感的細胞,可適當降低鋪板密度。
4. 即使在有蛋白(如 10%的血清)存在的情況下,DNA-PEI 復合物仍能轉染
細胞,但是 DNA-PEI 復合物必須在無蛋白存在的條件下形成。我們推薦使用
Opti-MEM ITM 培養基以達到最佳轉染效率。其他的無蛋白培養基則需測試與
線性 PEI 轉染試劑的兼容性。
5. 對大多數細胞來而言,每 1 μg DNA 使用 3.0 μL PEI 轉染試劑都能獲得較
高轉染效率。使用 者也可嘗試每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 體積線性 PEI。
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)為 BIOHUB 公司生產的
化合物產品,每批產品出廠前都經過嚴格的檢測,保證每批產品都
100%合格、穩定且高品質,但由于作為轉染試劑使用過程中有很多實
驗室因素(配置方法,PH,水純度,稱量的準度,dna RNA 純度,細胞狀
態,細胞品系…)造成溶解出現問題或者轉染效率出現差異,所以廠家
只受理該產品純度,分子量及重量缺失破損等相關投訴,針對極個別
客戶溶解問題和轉染效率問題我們只能友善解決,所以不能保證您能
獲得滿意答復,對于產品產品轉染效率不高,轉染批間有差異,轉染
不了等問題,不作為評價我們售后工作的依據。
本手冊只是一個基本操作手冊,具體轉染過程中需要根據實驗進行
優化,優化方向為混合時間,轉染時間,DNA 混合比例.......
? 如果我們提供的 PEI 手冊都無法解答您的問題,建議您可以多看文
獻,多調整一下轉染條件,找出適合自己細胞的轉染方法。如果無暇
摸索條件,您也可以直接購買我們配置好細胞轉染液,這樣免去您很
您很多煩惱,謝謝理解。
轉染操作流程:(瞬時轉染方法) 轉染效率(部分數據參考,本數據來源于網絡,不作為售后投訴依據)
1. 接種細胞: 轉染前一天,用膠原酶(WORTHINGTONG 公司 LS004196)消化細
胞并計數(不建議用胰酶)。調整細胞濃度,將細胞鋪入細胞培養的器皿,每個孔置
入的細胞量應能使轉染時細胞匯合度達到 70~80%。
2. 準備 DNA-PEI 復合物: DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其
升至室溫。,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他適合的無蛋白培養基稀釋適
量 DNA。用同樣的培養基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 線性 PEI 轉
染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液 的試管,一邊將稀釋的線性 PEI 轉染試劑滴
加至試管中(注意:請勿顛倒添加順序)。充分混勻后,室溫靜置 10~25 min 以
形成 DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時,請用圓底聚丙烯管,例如 NEST 5 mL /14
mL 離心管。
3. 轉染細胞: 直接向每個孔中加入 DNA-PEI 復合物并輕輕渦旋培養板/培養皿。在
無血清條件下轉染時,去除生長培養基,替換成無血清培養基,然后滴 DNA-PEI 復
合物。轉染 3 h 后,添加?體積的包含 30%血清的生長培養基。
4. 孵育細胞和分析結果: 在 CO2 培養箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉
染后最快 7 h 即可檢測到轉入基因的表達。 請自行確定最適合檢測時間。
細胞種類 中文名稱 PEI 轉染效率
HEK293 人胚腎細胞 90%-95%
293-T 人胚腎細胞 90%-95%
CHO-K1 倉鼠卵巢細胞 80%-90%
U251 人源神經膠質瘤細胞 80%-90%
Hela 人源宮頸癌細胞 70%-80%
COS7 猴 SV40 轉化腎細胞 70%-80%
HepG2 人源肝癌細胞 70%-80%
NIH/3T3 小鼠胚胎成纖維細胞 60%-70%
膠質瘤干細胞 人源膠質瘤干細胞 60%-70%
Patu8988 人源胰腺癌細胞 60%-70%
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